原理——DNA的半保留复制 DNA 在进行复制的时候链间氢键断裂，双链解旋分开，每条链作为模板在其上合成互补链，经过一系列酶的作用生成两个新的DNA分子。 变性：模板DNA在95℃高温下变性，双链打开变成单链。 退火：被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结 延伸：模板DNA-引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，靶序列为模板，按碱基互补配对原则和半保留复制原理，引物沿着5'→3'的方向合成新的DNA链。 PCR体系 PCR模板DNA PCR模板可以是任何DNA来源，如基因组DNA（gDNA）、互补DNA（cDNA）和质粒DNA。不过，DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型，所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要，因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险，tp钱包官网而起始量过低会降低得率。 引物 Primers（引物）是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合（通过碱基互补配对）。在PCR反应期间，DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此，引物结合位点必须是靶标附近所特有的，并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性，以确保目的片段的特异性扩增。 dNTPs dNTPs（核苷酸）由四个基本核苷酸组成。 缓冲体系 PCR buffer能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5，一般使用Tris-HCl来调节。镁离子作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子，其可促进引物的吸附。也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用，尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键，因此可增强反应特异性。 PCR实验操作 1.在进行基因克隆或者载体构建的实验中我们使用高保真DNA聚合酶 2.按照说明书准备高保真酶mix、DNA模板、引物、双蒸水 3.查看引物单信息，核对引物浓度和Tm值 研究生 pcr引物设计 研究生日常 pcr引物 pcr实验